Thành viên:Cao Xuân Hiếu/Note: Protocol tách protein từ inclusion bodies trong điều kiện biến tính

Từ VLOS
Bước tới: chuyển hướng, tìm kiếm

Thông thường khi sản xuất lượng lớn protein ngoại sinh trong tế bào E.coli thì những protein này được xuất vào những thể đặc có màng vững chắc (inclusion bodies, IBs) ngay cả khi siêu âm. Để tách nhanh, sạch và hiệu quả protein trong IBs trong điều kiện biến tính có thể tiến hành như sau:

  1. Thu tế bào bằng ly tâm 8000rpm trong 10 phút, 4°C
  2. (Có thể) Rửa tế bào 1 lần bằng PBS nếu thu lượng lớn (hơn 200 mL dịch nuôi cấy)
  3. Hòa (resuspension) tế bào trong đệm tách với tỷ lệ 10 OD unit/mL. Thành phần đệm: 50 mM TEA, 250 mM sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, DNase 20 μg/mL, 1mM PMSF
  4. Siêu âm phá tế bào 30s x 5 lần (output = 2, duty = 60% đối với <500 μl dịch). Lưu 20 μl dịch để điện di kiểm tra (5 μl ~ 0.05 OD unit)
  5. Ly tâm thấp 6.000 rpm trong 10 phút, 4°C. Lưu 20 μl dịch nổi để điện di kiểm tra (5 μl ~ 0.05 OD unit)
  6. (Có thể) Ly tâm phần dịch nổi còn lại 13.000 rpm trong 20 phút, 4°C. Điện di kiểm tra phần dịch nổi (5 μl ~ 0.05 OD unit) và cặn (hòa với Sol Mix 2x tỷ lệ 0.01 OD unit /μl
  7. Hòa cặn từ ly tâm thấp (bước 5) trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH=8.0 với tỷ lệ 0.1 OD unit/μl. Lưu 5 μl để điện di kiểm tra.
  8. Trộn dịch hòa cặn còn lại với 10V (10 lần thể tích) dung dịch rửa 1: Tris-HCl 20 mM, pH 8.0; 500 mM NaCl; 2% Triton X-100; 2 M Urea, lắc kỹ trong 15 phút tại 37°C
  9. Siêu âm phá màng 10s x 3 lần (output = 2, duty = 60% đối với <500 μl dịch).
  10. Ly tâm 6.000 rpm trong 10 phút, 4°C. Lưu dịch nổi để điện di kiểm tra (5 μl ~ 0.05 OD unit)
  11. Làm tan cặn trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH=8.0 với tỷ lệ 0.1 OD unit/μl. Lưu 5 μl để điện di kiểm tra.
  12. Rửa cặn 2 lần bằng dung dịch rửa 2: Tris-HCl 20 mM, pH 8.0; 500 mM NaCl; 2 M Urea, lắc mạnh và ly tâm 6.000 rpm trong 10 phút, 4°C. Lưu dịch nổi để điện di kiểm tra (5 μl ~ 0.05 OD unit)
  13. Làm tan cặn sau khi rửa trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH=8.0 với tỷ lệ 0.1 OD unit/μl. Lưu 5 μl để điện di kiểm tra.
  14. Trộn dịch hòa cặn còn lại với 10V (10 lần thể tích) dung dịch tách: Tris-HCl 20 mM, pH 8.0; 500 mM NaCl; 2 M Urea; 1mM ß-mercaptoethanol (5 mM Imidazole nếu sau đó muốn tinh sạch bằng cột His-tag), lắc kỹ trong 60 phút tại 37°C
  15. Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút, 20°C. Dịch nổi sẽ chứa protein quan tâm. Điện di kiểm tra (5 μl ~ 0.05 OD unit)
  16. Làm tan cặn với Sol Mix 2x với tỷ lệ 0.01 OD unit /μl. Điện di 0.05 OD unit để kiểm tra
  17. (Có thể) Các phân đoạn dịch nổi và cặn ở bước 10, 11, 12, 13 có thể cần tủa protein bằng 50% Acentone, 20% TCA để kết quả điện di không bị ảnh hưởng bởi Triton X-100.

Liên kết ngoài[sửa]


Bài cùng thể loại[sửa]

Liên kết đến đây

Lấy từ “https://tusach.thuvienkhoahoc.com/index.php?title=Thành_viên:Cao_Xuân_Hiếu/Note:_Protocol_tách_protein_từ_inclusion_bodies_trong_điều_kiện_biến_tính&oldid=89795”