Thành viên:Cao Xuân Hiếu/Note: Làm sạch nhanh sản phẩm PCR để giải trình tự
Thông thường sau khi chạy PCR, trong trường hợp tốt nhất là chỉ có 1 sản phẩm duy nhất (đặc hiệu) thì mẫu vẫn còn bị lẫn tạp với 1 lượng primer, dNTP dư và enzyme DNA polymerase. Nhưng chất lẫn tạp này có khả năng ảnh hưởng đến phản ứng giải trình tự Sanger (sử dụng ddNTP). Để loại bỏ chất lẫn tạp, thông thường ta sử dụng kit tinh sạch sản phẩm PCR trong đó gồm 3 bước chính: 1) chỉnh pH dung dịch sản phẩm; 2) giữ và rửa sản phẩm PCR trên màng của cột; 3) thu hồi DNA trong dung dịch đệm hoặc H2O. Sản phẩm thu được thường sạch dNTP và cả protein nhưng cũng bị thất thoát 1 lượng nhất định (khoảng 75% giá trị A260 của lượng cho vào).
Có một cách có thể loại bỏ nhanh primer và dNTP dư cho phép sử dụng sản phẩm PCR để giải trình tự DNA (BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Reactions). Các ưu điểm của phương pháp này so với tinh sạch bằng cột.
- Đơn giản (không phải thao tác nhiều, chỉ cần trộn sản phẩm với hỗn hợp enzyme và ủ ở điều kiện tương ứng)
- Rẻ (sử dụng enzyme của Fermentas giá phải chăng so với kit tinh sạch cùng loại)
- Lượng đầu vào ít (chỉ cần 5ul của sản phẩm PCR)
- Dễ dàng sử dụng với số lượng mẫu lớn
Nhược điểm
- Tốn thời gian (mặc dù tổng thời gian cần cho 1 mẫu là khoảng 30 phút so với 10 phút nếu dùng cột tinh sạch nhưng tiết kiệm thời gian khi tinh sạch cùng lúc lượng lớn mẫu PCR (ví dụ 96 mẫu))
- Không loại bỏ muối, protein và bổ sung thêm 1 lượng mới protein (tuy nhiên đã kiểm nghiệm những chất lẫn tạp này không ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng giải trình tự - xem thí nghiệm dưới)
Chuẩn bị:
- Exonuclease I (Exo I) (Cat. No.: EN0582 của Fermentas)
- FastAP™ Thermosensitive Alkaline Phosphatase (Cat. No.: EF0651 của Fermentas)
- 2 block nhiệt (37oC và 85oC)
Thao tác:
- Trộn đều 5 ul sản phẩm PCR với hỗn hợp gồm 0.5ul của ExoI và 1ul FastAP. (Trong trường hợp nhiều mẫu thì có thể chuẩn bị Master Mix của 2 enzyme này)
- Ủ sản phẩm tại 37oC trong 15 phút
- Ủ sản phẩm tại 85oC trong 15 phút
- Chú ý: có thể cần ly tâm nhẹ để lắng mẫu giữa 2 lần ủ. Đối với microtiter plate thì có thể lập trình trên máy luân nhiệt (PCR).
Thí nghiệm kiểm chứng:
- Sử dụng 40 mẫu PCR từ phản ứng nhân một gene đặc hiệu (kích thước khoảng 800bp) từ 20 DNA khuôn khác nhau, mỗi khuôn lặp lại 2 lần.
- Mỗi mẫu lặp lại được tinh sạch hoặc bằng xử lý enzyme (như trên) hoặc bằng tinh sách qua cột (GeneJET™ PCR Purification Kit, Fermentas). Đối với tinh sạch bằng cột thì dùng 10 lần thể tích sử dụng cho xử lý enzyme (50ul của phản ứng PCR) và sau đó hòa tan bằng 1 thể tích tương đương.
- Đo nanodrop các sản phẩm PCR sau khi tinh sạch
- Lấy 160ng của mỗi mẫu PCR sau tinh sạch để xác định trình tự với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit trên hệ thống ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer
Kết quả
- Nanodrop:
|
Mô hình chung của kết quả quang phổ hấp thụ của mẫu trước tinh sạch (đen), sau khi xử lý enzyme (đỏ) và sau khi tinh sạch qua cột (xanh lục)
|
Phân bố chênh lệch nồng độ DNA thu được trước và sau 2 phương pháp tinh sạch
Kiểm định ANOVA 2 chiều cho thấy không có sự khác biệt giữa 2 nhóm trước và sau xử lý enzyme (P = 0,525, hiệu số sai khác trung bình = 5%); trong khi đó có sự khác biệt đáng kể giữa 2 nhóm trước và sau tinh sạch qua cột (1,250E-011, hiệu số sai khác trung bình = 73%) |
- Giải trình tự
|
|
|
|
|
|
|
Kiểm
định
paired
t-test
cho
thấy
không
có
sự
khác
biệt
giữa
2
nhóm
với
P
=
0,078
Giá trị trung bình +/- SD: 780,600 +/- 14,862 (enzyme) || 765,600 +/- 30,639 (cột) |
Kiểm định paired t-test cho thấy không có sự khác biệt giữa 2 nhóm với P = 0,518 Giá trị trung bình +/- SD: 702,750 +/- 96,055 (enzyme) || 683,250 +/- 83,762 (cột) |
Kết luận
- DNA bị mất không đáng kể (5%) khi làm sạch sản phẩm PCR bằng xử lý enzyme
- Sản phẩm PCR sau khi xử lý enzyme có thể sử dụng cho phản ứng xác định trình tự cho kết quả không khác biệt với sản phẩm được tinh sạch bằng kit/cột
Lưu ý
- Công ty Fermentas không khuyến khích việc sử dụng phương pháp làm sạch này cho sản phẩm PCR để phục vụ mục đích tách dòng phân tử
Liên kết ngoài[sửa]
- Protocol for PCR Product Clean-up, Fermentas
- Werle, E., et al., Convenient single-step, one tube purification of PCR products for direct sequencing, Nucleic Acids Res., 22, 4354-4355, 1994.
Bài cùng thể loại[sửa]
- Kỹ thuật PCR căn bản
- Protocol tách protein từ inclusion bodies trong điều kiện biến tính
- Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn
