Phương pháp giám định vi khuẩn trong PTN

Từ Thư viện Khoa học VLOS
Bước tới: chuyển hướng, tìm kiếm


ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi sinh vật (microorganisms) là những sinh vật nhỏ bé đến mức chỉ có thể thấy được chúng dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Vi sinh vật gây ra rất nhiều bệnh hiểm nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm. Tuy nhiên số vi sinh vật gây bệnh chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong thế giới vi sinh vật. Từ xa xưa người ta đã biết ứng dụng các vi sinh vật có ích (tuy chưa hề biết tới sự tồn tại của chúng) để chế biến thực phẩm ( như nấu rượu, làm tương, mắm, nước mắm, giấm, sữa chua, chao, muối dưa, muối cà, ...), ủ phân, ngâm vỏ cây lấy sợi, xếp ải đất, trồng luân canh với cây họ Đậu...; hoặc sử dụng các biện pháp để ngăn chặn tác hại của vi sinh vật (như ướp muối thịt, cá, làm mứt, phơi khô củ cải, tôm, cá...).

Sau việc Leeuwenhoek phát hiện ra vi sinh vật và việc Louis Pasteur phát hiện ra bản chất của các vi sinh vật- từ đó khai sinh ra ngành Vi sinh vật học (Microbiology)- thì nhân loại bắt đầu quan tâm rất nhiều đến lĩnh vực khoa học mới mẻ này.

Vi sinh vật học trở thành nền tảng cho sự phát triển của Công nghệ sinh học(CNSH). Người ta chia sự phát triển của CNSH ra thành 3 giai đoạn:

  • CNSH truyền thống là các quá trình dân dã nhằm chế biến , bảo quản các loại thực phẩm, xử lý đất đai, phân bón để phục vụ nông nghiệp...
  • CNSH cận đại là quá trình sử dụng các nồi lên men công nghiệp để sản xuất ở quy mô lớn các sản phẩm sinh học như mỳ chính (bột ngọt), lizin và các axít amin khác, các acid hữu cơ, các dung môi hữu cơ, chất kháng sinh, một số vitamin (như vitamin B2, B12, C...), nhiều loại enzym...
  • CNSH hiện đại chia ra các lĩnh vực như CN di truyền (genetic engineering), công nghệ tế bào (cell engineering), công nghệ enzym và protein (enzyme/protein engineering), CN vi sinh vật/ CN lên men (microbial engineering / fermentation), CN môi trường (environmental engineering). CNSH hiện đại thường gắn liền với các cơ thể mang gen tái tổ hợp ( recombination gene).

Vi sinh vật học là khoa học nghiên cứu về các cơ thể hoặc các nhân tố quá nhỏ đến mức không thấy được bằng mắt thường, tức là các vi sinh vật. Vi sinh vật học đang được giảng dạy trong rât nhiều trường Đại học, Cao đẳng, Trung học chuyên nghiệp và cũng được đề cập đến ít nhiều ở bậc phổ thông. Vi sinh vật học là những kiến thức liên quan đến cuốc sống của mọi người. Đặc biệt là vi khuẩn hiện nay cũng đang là vấn đề quan tâm. Bài tiểu luận “Các phản ứng sinh hóa giám định vi khuẩn trong phòng thí nghiệm” với mục đích: Nhằm đưa ra các phương pháp để giám định vi khuẩn một cách chính xác. Để chúng ta có thể nghiên cứu đúng loại vi khuẩn, và việc xác định này mang lại rất nhiều ý nghĩa trong thực tiễn. Với mong muốn như vậy em rất mong được sự đóng góp ý kiến từ Thầy giáo và của tất cả các anh chị, các bạn quan tâm đến vấn đề này.

Em xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp từ Thầy giáo, và tất cả các anh chị, các bạn quan tâm.

Sinh viên: Phạm Văn Hưng

GIẢI QUYẾT VẤN ĐỀ

GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN

Cấu trúc tế bào vi khuẩn:

Thành tế bào

Thành tế bào (cell wall) giúp duy trì hình thấi của tế bào, hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao (flagellum) , giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào , cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên , tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể (bacteriophage).

Năm 1884 H.Christian Gram đã nghĩ ra phương pháp nhuộm phân biệt để phân chia vi khuẩn thành 2 nhóm khác nhau : vi khuẩn Gram dương (G+) và vi khuẩn Gram âm (G-). Phương pháp nhuộm Gram về sau được sử dụng rộng rãi khi định loại vi sinh vật. Thành phần hoá học của 2 nhóm này khác nhau chủ yếu như sau :


Gram dương Gram âm Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào Peptidoglycan 30-95 5-20 Acid teicoic (Teichoic acid) Cao 0 Lipid Hầu như không có 20 Protein Không có hoặc có ít Cao

Màng sinh chất (plasma membrane); Màng ngoài (outer membrane); Chu chất (Periplasmic space)

Peptidoglycan là loại polyme xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi 3 thành phần:

  • N-Acetylglucosamin ( N-Acetylglucosamine, NAG)
  • Acid N-Acetylmuramic (N-Acetylmuramic acid, NAM)
  • Tetrapeptid chứa cả D- và L- acid amin


Thành tế bào vi khuẩn Gram dương


Thành tế bào vi khuẩn Gram âm

Màng sinh chất

Màng sinh chất hay Màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, CM) ở vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Chúng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL), chiếm 30-40% khối lượng của màng, và các protein (nằm trong, ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60-70% khối lượng của màng. Đầu phosphat của PL tích điện, phân cực, ưa nước ; đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵ nước.

CM có các chức năng chủ yếu sau đây:

  • Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất
  • Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào.
  • Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của bao nhày (capsule).
  • Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng)
  • Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp.
  • Cung cấp năng lượng cho sự hoạt động của tiên mao

Sinh viên điền chú thích theo hướng dẫn của giáo viên


Cấu trúc của đầu và đuôi của phospholipid

Tế bào chất

Tế bào chất (TBC-Cytoplasm) là phần vật chất dạng keo nằm bên trong màng sinh chất, chứa tới 80% là nước. Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp. Bào quan đáng lưu ý trong TBC là ribosom (ribosome). Ribosom nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của TBC. Ribosom gồm 2 tiểu phần (50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S. S là đơn vị Svedberg- đại lượng đo tốc độ lắng khi ly tâm cao tốc. Cấu trúc của ribosom vi khuẩn so với ribosom 80S ở các sinh vật nhân thật (nấm, thực vật, động vật) được trình bày trong bảng sau đây (Giáo viên giảng để sinh viên chú thích vào hình bằng tiếng Việt)

Ribosom ở vi khuẩn


So sánh Ribosom ở Vi khuẩn và ở các Sinh vật nhân thật (Eukaryotic ribosome)

Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ như các hạt glycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, các hạt dị nhiễm sắc (metachromatic body), các giọt lưu huỳnh...

Ở loài vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis và Bacillus sphaericus còn gặp tinh thể độc (parasoral body) hình quả trám, có bản chất protein và chứa những độc tố có thể giết hại trên 100 loài sâu hại (tinh thể độc chỉ giải phóng độc tố trong môi trường kiềm do đó các vi khuẩn này hoàn toàn vô hại với người, gia súc, gia cầm, thuỷ hải sản- có hại đối với tằm). Bacillus sphaericus có thể diệt cung quăng của các loài muỗi.


Bào tử (spore) và Tinh thể độc (Crystal) ở Bacillus thuringiensis (trái) và Bacillus sphaericus (phải).

Thể nhân

Thể nhân ( Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó là 1 nhiễm sắc thể (NST, chromosome) duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép (ở Xạ khuẩn Streptomyces có thể gặp nhiễm sắc thể dạng thẳng). NST ở vi khuẩn Escherichia coli dài tới 1mm (!), có khối lượng phân tử là 3.109, chứa 4,6.106 cặp base nitơ. Thể nhân là bộ phận chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn.

*

Thể nhân trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli.

Ngoài NST, trong tế bào nhiều vi khuẩn còn gặp những ADN ngoài NST. Đó là những ADN xoắn kép có dạng vòng khép kín, có khả năng sao chép độc lập, chúng có tên là Plasmid.

Bao nhầy

Bao nhầy hay Giáp mạc (Capsule) gặp ở một số loài vi khuẩn với các mức độ khác nhau:

  • Bao nhầy mỏng ( Vi giáp mạc, Microcapssule)
  • Bao nhầy (Giáp mạc, Capsule)
  • Khối nhầy ( Zooglea)

Muốn quan sát bao nhầy thường lên tiêu bản với mực tàu, bao nhày có màu trắng hiện lên trên nền tối.

Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid và protein. Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose, acid 2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic...

Ý nghĩa sinh học của bao nhầy là:

  • Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn, bảo vệ vi khuẩn tránh bị thực bào (trường hợp Phế cầu khuẩn-Diplococcus pneumoniae)
  • Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn
  • Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan...)
  • Giúp vi khuẩn bám vào giá thể ( trường hợp các vi khuẩn gây sâu răng như Streptococcus salivarrius, Streptococcus mutans...)

Vi khuẩn Acetobacter xylinum có bao nhầy cấu tạo bởi cellulose. Người ta dùng vi khuẩn này nuôi cấy trên nước dừa để chế tạo ra Thạch dừa (Nata de coco).

dừa (Nata de coco)

Vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides có bao nhầy dày chứa hợp chất polyme là Dextran có tác dụng thay huyết tương khi cấp cứu mà thiếu huyết tương. Sản phẩm này rất quan trọng khi có chiến tranh. Vi khuẩn này thường gặp ở các nhà máy đường và gây tổn thất đường trong các bể chứa nước ép mía. Nhờ enzym dextransuccrase mà đường saccarose bị chuyển thành dextran và fructose.

Vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides

Một số bao nhầy của vi khuẩn còn được dùng để sản xuất Xantan (Xanthane) dùng làm chất phụ gia trong công nghiệp dầu mỏ.

Tiên mao và khuẩn mao

Tiên mao (Lông roi, flagella) không phải có mặt ở mọi vi khuẩn, chúng quyết định khả năng và phương thức di động của vi khuẩn. Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rất rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao. Để xác định xem vi khuẩn có tiên mao hay không còn có cách thử gián tiếp nhằm biết khả năng di động của chúng. Cấy bằng que cấy nhọn đầu vào môi trường thạch đứng chứa 0.4% thạch (agar-agar), còn gọi là môi trường thạch mềm. Nếu thấy vết cấy lan nhanh ra xung quanh thì chứng tỏ là vi khuẩn có tiên mao, có khả năng di động.

Tiên mao có thể gốc (basal body), gồm 1 trụ nhỏ được gắn với 4 đĩa tròn (vi khuẩn G - ) có dạng vòng nhẫn (ring), ký hiệu là các vòng L,P,S và M. Vòng L nằm ngoài cùng, tương ứng với lớp liposaccarid của màng ngoài ; vòng P tương ứng với lớp peptidoglycan, vòng S tương ứng với lớp không gian chu chất ; vòng M nằm ở trong cùng. Vi khuẩn G+ chỉ có 2 vòng : 1 vòng nằm ngoài tương ứng với thành tế bào và 1 vòng trong tương ứng với màng sinh chất. Xuyên giữa các vòng là 1 trụ nhỏ (rod) có đường kính 7nm. Bao bọc tiên mao ở phần phía ngoài là một bao ngắn có hình móc (hook). Sợi tiên mao (filament) dài khoảng 10-20m và có đường kính khoảng 13-20nm. Đường kính của bao hình móc là 17nm. Khoảng cách giữa vòng S và vòng M là 3mm, giữa vòng P và vòng L là 9nm, giữa vòng P và vòng S là 12nm. Đường kính của các vòng là 22nm, đường kính các lỗ ở các vòng là 10nm. Khoảng cách từ mặt ngoài của vòng L đến mặt trong của vòng M là 27nm. Sợi tiên mao cấu tạo bởi loại protein có tên là flagellin, có trọng lượng phân tử là 30 000-60 000. Một số vi khuẩn có bao lông (sheath) bao bọc suốt chiều dài sợi, như ở trường hợp chi Bdellovibrio hay vi khuẩn tả Vibrio cholera.


Tiên mao và khuẩn mao ở vi khuẩn


Tiên mao ở VK Gram dương Tiên mao ở VK Gram âm


Tiên mao ở vi khuẩn G +


Tiên mao ở vi khuẩn G -

Các tiểu phần (subunit) của flagellin được tổng hợp từ các hạt ribosom nằm gần màng sinh chấy tổng hợp nên và đi qua lõi mà tạo dần thành sợi tiên mao

Tiên mao của vi khuẩn có các loại khác nhau tuỳ từng loài :

  • Không có tiên mao (vô mao, atrichia)
  • Có 1 tiên mao mọc ở cực ( đơn mao, monotricha)
  • Có 1 chùm tiên mao mọc ở cực ( chùm mao, lophotricha)
  • Có 2 chùm tiên mao mọc ở 2 cực ( song chùm mao, amphitricha)
  • Có nhiều tiên mao mọc khắp quanh tế bào (chu mao, peritricha)

Có loại tiên mao mọc ở giữa tế bào như trường hợp vi khuẩn Selenomonas ruminantium.

Các loại tiên mao ở vi khuẩn

Kiểu sắp xếp tiên mao liên quan đến hình thức di động của vi khuẩn. Tiên mao mọc ở cực giúp vi khuẩn di động theo kiẻu tiến- lùi. Chúng đảo ngược hướng bằng cách đảo ngược hướng quay của tiên mao. Vi khuẩn chu mao di động theo hướng nào thì các tiên mao chuyển động theo hướng ngược lại. Khi tiên mao không tụ lại về một hướng thì vi khuẩn chuyển động theo kiểu nhào lộn. Tốc độ di chuyển của vi khuẩn có tiên mao thường vào khoảng 20-80µm/giây, nghĩa là trong 1 giây chuyển động được một khoảng cách lớn hơn gấp 20-80 lần so với chiều dài của cơ thể chúng.

Các chi vi khuẩn thường có tiên mao là Vibrio, Spirillum, Pseudomonas, Escherichia, Shigella, Salmonella, Proteus... Ở các chi Clostridium, Bacterium,Bacillus, ...có loài có tiên mao có loài không. Ở cầu khuẩn chỉ có 1 chi (Planococcus) là có tiên mao

Xoắn thể có một dạng tiên mao đặc biệt gọi là tiên mao chu chất (periplasmic flagella), hay còn gọi là sợi trục ( axial fibrils), xuất phát từ cực tế bào và quấn quang cơ thể. Chúng giúp xoắn thể chuyển động được nhờ sự uốn vặn tế bào theo kiểu vặn nút chai.

Xoắn thể (Spirochete) quan sát dưới kính hiển vi nền đen.



AF: Sợi trục PC: Ống nguyên sinh chất OS: Vỏ ngoài IP: Lỗ nối

Cơ chế chuyển động uốn vặn tế bào ở Xoắn thể ( OS, AF, PC- xem chú thích ở hình trên).

Khuẩn mao và Khuẩn mao giới

Khuẩn mao (hay Tiêm mao, Nhung mao , Fimbriae) là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn mọc quanh bề mặt tế bào nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có đường kính khoảng 7-9nm, rỗng ruột (đường kính trong là 2-2,5nm), số lượng khoảng 250-300 sợi/ vi khuẩn. Kết cấu của khuẩn mao giản đơn hơn nhiều so với tiên mao. Chúng có tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể ( nhiều vi khuẩn gây bệnh dùng khuẩn mao để bám chặt vào màng nhầy của đường hô hấp, đường tiêu hoá, đường tiết niệu của người và động vật).

Khuẩn mao ở vi khuẩn E.coli

Có một loại khuẩn mao đặt biệt gọi là Khuẩn mao giới (Sex pili, Sex pilus-số nhiều) có thể gặp ở một số vi khuẩn với số lượng chỉ có 1-10/ vi khuẩn. Nó có cấu tạo giống khuẩn mao , đường kính khoảng 9-10nm nhưng có thể rất dài. Chúng có thể nối liền giữa hai vi khuẩn và làm cầu nối để chuyển vật chất di truyền (ADN) từ thể cho (donor) sang thể nhận (recipient). Quá trình này được gọi là quá trình giao phối (mating) hay tiếp hợp (conjugation). Một số thực khuẩn thể (bacteriophage) bám vào các thụ thể (receptors) ở khuẩn mao giới và bắt đầu chu trình phát triển của chúng

Chính nhờ cấu trúc của vi khuẩn như vậy mà quyết định đến những phản ứng sinh hóa để có thể xét nghiệm và giám định được vi khuẩn.