Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới - 454 Pyrosequencing (untill now)
Kỹ thuật pyrosequencing 454 được sáng tạo đầu tiên bởi Pål Nyrén và Mostafa Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển năm 1996.
Kỹ thuật này được phát triển bởi công ty 454 Life Science, là một hệ thống giải trình tự DNA hai bước có độ tương đồng cao với dung lượng lớn hơn rất nhiều so với hệ thống giải trình tự Sanger. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tự bằng tổng hợp” bao gồm khởi động một sợi DNA được giải trình tự, và giải trình sợi DNA bổ sung bằng phản ứng của enzyme. Đây là một hệ thống được kết hợp với việc khuếch đại số lượng lớn các đoạn DNA kèm cùng pyrosequencing dung khối lớn trong các giếng picotiter. Nguyên lý “giải trình tự bằng việc tổng hợp” cũng dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide.
Phương thức hoạt động[sửa]
Khái quát: 454 pyrosequencing là một phương pháp tạo ra nhiều đoạn DNA có sự tương đồng cao. Đầu tiên DNA được cắt thành các đoạn đầu bằng (blunt end), và được gắn các oligonucleotide adaptor vào cả hai đầu. Từng đoạn này sau đó gắn với một hạt thủy tinh, và sẽ được khuếch đại bằng PCR trong các giọt nhũ dầu-nước, tạo ra nhiều bản sao đoạn DNA trên mỗi hạt thủy tinh. Sau đó các hạt thủy tinh được giữ trong các giếng picotiter trên một cơ chất dạng sợi, và giải trình tự.
Quá trình giải trình tự diễn ra qua 5 bước (sử dụng hệ thống Genome Sequence LFX cho việc giải trình tự hệ phiên mã-transcriptome). Đầu tiên, sợi khuôn, một sản phẩm PCR sợi đơn, được lai với một primer giải trình tự và sau đó được ủ với các enzyme DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase cũng như các cơ chất adenosine 5’ phosphosulfate (APS) và luciferin. Khi dNTP đầu tiên được bắt cặp bổ sung, nó được gắn với sợi DNA khuôn nhờ DNA polymerase và kèm theo sẽ giải phóng một PPi. PPi được biến đổi thành ATP nhờ enzyme ATP sulfyrelase cùng với sự tham gia của APS, sau đó một phản ứng được xúc tác bởi licuferase sẽ biến đồi luciferin thành oxyluciferin - tạo ra ánh sánh nhìn thấy, có độ sáng tương ứng với lượng ATP tạo thành. Ánh sáng này được nhận viết bởi một camera và phân tích bởi một chương trình phần mềm.
Apyrase làm suy biến các nucleotide không bắt cặp và ATP. Sau quá trình làm suy biến, phản ứng bắt đầu lại với nucleotide khác được gắn vào. Sau một quá trình liên tục, sợi DNA bổ sung được tổng hợp xong và việc giải trình tự nucleotide được xác định từ các đỉnh tín hiệu dựa trên "dấu vết của pyrogram (pyrogram trace)".
Một số hạn chế[sửa]
Phần mềm Newbler tập hợp dữ liệu đọc trong “flow space” hơn là “nucleotide space”, nói cách khác, nó xác định mật độ ánh sáng (light intensity) chứ không dự đoán trình tự các đoạn đọc. Thiết bị tập hợp trình tự được thiết kế để sửa các lỗi hệ thống kết hợp với kỹ thuật pyrosequencing như các lỗi liên quan tới chuỗi đồng hình (homopolymer). Chất lượng các bản đọc trình tự của 454 pyrosequencing và kết quả tập hợp dữ liệu không được mô tả chính xác. Giới hạn khác là chiều dài các đoạn đọc ngắn từ hệ thống 454, khoảng 300-500 nucleotide, ngắn hơn đoạn đọc bởi phương pháp kết thúc chuỗi – Sanger (800-1000 nucleotide); điều này có thể dẫn đến sự khó khăn khi tập hợp đoạn, nhất là đối với các trình tự DNA lặp. Các trình tự ngắn được giải trình tự, thiết bị tập hợp trình tự Newbler của 454 được cho là thực hiện kém hiệu quả đối với các vùng lặp lại. Tuy nhiên, vấn đề này có thể giải quyết bằng phương pháp là kết hợp thông tin nối tiếp (scaffold information) từ các trình tự kết thúc được tạo dòng theo cách truyền thốn bằng dữ liệu của kỹ thuật 454.
Kết luận[sửa]
Sức mạnh của kỹ thuật pyrosequencing gồm tính linh hoạt cao khi kết cặp primer, phân tích được nhiều đột biến, dữ liệu và thông tin trình tự tập hợp được đầy đủ. Kỹ thuật này có tính nhạy cao hơn hẳn so với phương pháp giải trình tự truyền thống với độ chính xác là 99,9% với các đoạn 200 base và 99% với các đoạn 400 base. Hệ thống giải trình tự được 400-600 triệu bp trong 10 giờ vì vậy giá thành thấp hơn khi giải trình tự lượng lớn DNA với thời gian nhất định so với khi sử dụng phương pháp Sanger – mất nhiều ngày để giải trình tự một lượng DNA tương đương.. Kỹ thuật này cùng với các kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới khác, có nhiều ảnh hưởng đến hoạt động nghiên cứu với lượng dữ liệu đầu vào lớn được xử lý trong thời gian ngắn hơn đã tạo ra một đột phá trong nhiều lĩnh vực sinh học như công nghệ sinh học, khoa học pháp ý và hệ thống học, cũng như y học. Đến năm 2007, kỹ thuật pyrosequencing trở nên phổ biến cho các ứng dụng lập trình trự (resequencing) và giải trình tự (sequencing) genome và đối với genome có họ hàng gần.
Các sợi khuôn đem giải trình tự có thể được chuẩn bị bằng cả hai phương pháp là: chuẩn bị sợi khuôn pha rắn – solid phase template preparation (streptavidin-coated magnetic bead, hạt thủy tinh từ tính có bọc streptavidin) và chuẩn bị sợi khuôn mang enzyme – enzymatic template preparation (apyrase và exonuclease).
Công ty 454 đã phát triển mới kỹ thuật pyrosequencing dựa trên array, và trở thành kỹ thuật nền tảng hữu hiệu cho việc giải trình DNA dữ lượng lớn. Nó trở nên nổi bật với ứng dụng vào giải trình tự genome và ngành metagenomics. Nền tảng kỹ thuật pyrosequencing GS FLX của công ty 454 Life Science có thể tạo ra 400 triệu nucleotide trong 10 giờ bởi một máy, và giá thành khoảng 5,000 – 7,000 USD cho mỗi lần chạy.
Tham khảo[sửa]
Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology Tập tin:PyrSeq.full.pdf
