Định lượng mRNA cụ thể bằng real-time PCR trên máy LightCycler (Roche)
Phân tích những thay đổi về biểu hiện gene là một trong những nhiệm vụ quan trọng trong các nghiên cứu ở lĩnh vực sinh học phân tử. Những kỹ thuật định lượng mức độ phiên mã của một gene thường được áp dụng phổ biến là Northern blot, slot/dot blot, DNA arrays và PCR phiên mã ngược (RT-PCR). Trong đó, RT-PCR là phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao.
Thông thường, cách thức xác lập các đường chuẩn hay mẫu đối chứng là rất quan trọng trong nghiên cứu định lượng. Một số trường hợp định lượng thường dựa trên mức độ biểu hiện của các housekeeping genes. Tuy nhiên, trong các điều kiện thí nghiệm ngặt nghèo (vd. nghiên cứu phản ứng của vi khuẩn trong các điều kiện đói dinh dưỡng hoặc bị stress) thì các housekeeping cũng bị ảnh hưởng và không giữ ổn định giữa mẫu đối chứng và các mẫu thí nghiệm. Phương pháp giới thiệu dưới đây sử dụng đường chuẩn ngoài mẫu được xây dựng từ chính những transcript của gene nghiên cứu được tạo ra từ T7 RNA polimerases và định lượng bằng hệ thống LightCycler của Roche.
Mục lục
Tách RNA tổng số[sửa]
- Tế bào vi khuẩn được phá bằng máy RiboLyser. RNA tổng số được tách từ tế bào theo phương pháp acid Phenol sử dụng kit MagNA Pure LC RNA isolation của Roche và tự động hóa dưới điều khiển của hệ thống KingFisher.
- Độ sạch, độ toàn vẹn và nồng độ của RNA tổng số có thể kiểm định bằng RNA 6000 Nano Chip trên hệ thống Agilent 2100 Bioanalyzer.
Khuyếch đại đoạn phiên mã bằng PCR và T7 RNA polymerase[sửa]
- Thiết kế primer nhân 1 đoạn đặc hiệu trên vùng mang mã của gene với kích thước trên dưới 300bp. Trên primer reverse đặt thêm vùng T7 promoter phía đầu 5' (có thể dùng trình tự T3 hay SP6 promoter nếu muốn sử dụng enzyme RNA Polymerase tương ứng).
- Khuyếch đại đoạn phiên mã bằng cặp mồi trên từ khuôn là DNA của vi khuẩn. Tinh sạch sản phẩm PCR.
- Dùng sản phẩm PCR làm khuẩn để tổng hợp các đoạn phiên mã tương ứng bằng enzyme T7 RNA polymerase. Thủy phân khuôn DNA bằng cách xử lý mẫu với DNAseI và định lượng nồng độ đoạn phiên mã bằng NanoDrop.
Xây dựng đường chuẩn nồng độ đoạn phiên mã[sửa]
- Pha loãng các đoạn phiên mã thành các dung dịch chứa 20 ul của 2.2 E+9, 2.2 E+8, 2.2 E+7, 2.2 E+6 và 2.2 E+5 phân tử phiên mã cùng với 10ug của MS2 RNA (từ phage). Mẫu đối chứng âm chứa 10ug MS2 RNA.
- Định lượng mRNA của các dung dịch pha loãng trên và mẫu đối chứng âm dùng hóa chất của bộ kit RNA Master SYBR Green I. Mỗi mẫu lặp 2 lần.
- Chu trình nhiệt của phản ứng định lượng gồm 1) phiên mã ngược tại 61°C trong 20min; 2) biến tính khuôn (hot start 95°C 2min); 3) chu trình khuyếch đại và thu nhận tín hiệu huỳnh quanh từ SYBR Green I tại giai đoạn chuyển từ bước khuyếch đại sau mỗi chu kỳ sang bước biến tính tiếp theo; 4) biến tính sản phẩm tăng dần từ 65°C đến 95°C với tốc độ 0.1°C/s và thu nhận tín hiệu huỳnh quang liên tục
- Phân tích tính đặc hiệu của phản ứng PCR thông qua phân tích đường biến tính sản phẩm. Thông thường nếu phản ứng đặc hiệu thì sẽ xuất hiện 1 peak duy nhất. Nếu có peak thứ 2 thấp hơn và có ở cả mẫu đối chứng âm (thường bị biến tính hoàn toàn trước khi nhiệt độ tới 80°C thì đấy là peak của primer-dimer)
- Phân tích độ nhạy của phản ứng và độ tương quan giữa sản phẩm tạo thành và nồng độ khuôn ban đầu thông qua đường biểu diện nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ. Khi biểu diện đường này dưới dạng một đường tuyến tính thì độ dốc cho phép nằm trong khoảng từ -5.7 đến -2.9.
- Xuất kết quả thành đường chuẩn độ ngoài để sử dụng cho việc định lượng nồng độ mRNA đặc hiệu cho gene tương ứng ở các mẫu thí nghiệm.
Liên kết ngoài[sửa]
- Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System Biochemica (Roche, 2003).
- Weight to Molar Quantity (for nucleic acids) dùng để tính toán và chuyển đổi các loại nồng độ, phân tử lượng, số phân tử .v.v
