Hóa miễn dịch tổ chức
Chuẩn bị hóa chất[sửa]
(ghi chú: MW=molecular weight; khối lượng phân tử)
- Cồn tuyệt đối (ethanol absolute, C2H5OH, MW=46.07 g/mol)
- Xylene(Xylol, C6H4(CH3)2 MW=106.17 g/mol)
- Citric acid monohydrate (C6H8O7H2O, MW=210.14 g/mol)
- tri-Sodium citrate dehydrate (C6H5Na3O7.2H2O, MW=294.10 g/mol)
- Glycine(MW=75.1 g/mol)
- Ethylenediaminetetracetic acid, Disodium salt.2H2O (Na2-EDTA.2H2O, MW: 0372.24 g/mol)
- Hydrogen peroxide solution (30%)
- Di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4, MW=141.96 g/mol)
- Sodium chloride (NaCl, MW=58.44 g/mol)
- Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4, MW= 136.09 g/mol)
- Potassium chloride (KCl, MW074.56 g/mol)
- Bovine Albumin (BA) Fraction V Solution 7.5% (7.5g/100ml)
- Tween 20 (Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate)
- Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol), X-100
- DePex Mounting medium contains Xylene (mixture of isomers), Dibutylphthalate
- DAB+Chromogen (contains Biphenyl-3, 3’ 4, 4’- tetrayltetraammonium tatrachloride),
- Dung dịch Mayer’s Haematoxylin
Pha các loại dung dịch[sửa]
1) Cần các loại dung dịch: Xylol, nước cất, nước máy, dung dịch ethanol các nồng độ 75%, 96%, 100%
2) Pha 0.01 M dung dịch đệm Citrate có pH 6.0: 5,942 g muối ngậm 2.H2O trong 2 lít nước
3) Pha 1 lít dung dịch đệm (10X PBS):
NaCL: 80 g KCl: 2 g Na2HPO4: 11,5 g KH2PO4 : 2 g
Trộn đều và hòa tan trong nước cất
Chỉnh pH đến 6.8 (dùng 0.1N HCl)
4).
Blocking
peroxidase
solution:
Methanol: 90 ml
H2O2 30: 10 ml v.v.
5). DAKO antibody diluent
6). Envision polymer reagent: Envision TM/HRP, Rabbit/Mouse (ENV)
7). Mouse anti-proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (PC-10); Mouse monoclonal IgG2a, 200 μg/ml
8). Normal Goat serum blocking solution (chuẩn bị ngay trươcs khi dùng như sau:
Pha 3 ml:
Bovine albumin 7,5%: 400 μl
Goat normal serum: 30 μl
1X PBS: 2570 μl
9) Dung dịch Mayer’s Haematoxylin
10) DAKO DAB staining Kit:
DAB (20μl) + Chromogen solution + Substrate buffer (1 ml)
Tiêu bản gắn parafin[sửa]
1. Mô cần quan sát đã được cắt bằng microtome và gắn parafin trên phiến kính sau đó được làm khô (để qua đếm ở nhiệt độ phòng hoặc dùng bàn hấp ở 40 độ)
Các bước tiến hành[sửa]
Phương pháp dưới đây ứng dụng nhuộm cơ quan thụ cảm hormon estrogen beta từ tiêu bản gắn parafin của tử cung, bàng quang, tuyến tiền liệt (do GS Sari Mäkelä, Saija Savolainen, Teija Humerinta, Viện nghiên cứu y sinh Đại học Turku, FINLAND cung cấp).
Cần "giải phóng" mô khỏi parafin (deparaffinize): Đánh dấu tiêu bản (bao gồm cả các thông tin về kháng nguyên (antibody), độ pha loãng (dilution)
1. Rửa trong 3 hộp xylen đặt cạnh nhau (5 phút/1 hộp)
2. Rửa trong các hộp ethanol 100%(x3); 96%(x2); 75%(x1); (2 phút/hộp)
3. Nước cất: 5 phút
4. Đặt phiến kính trên khay có thanh nâng, phủ trên phần có gắn mô cần nhuộm bằng 0.01 M Citrate acid buffer pH 6.0.
5. "Nấu" trong Microwave 5 phút (750 watt)
6. Cho dung dịch đệm citrat đến mức bằng với trước khi "nấu" và để 1 phút ở nhiệt độ phòng
7. Nhắc lại bước 5
8. Tiếp tục cho thêm dung dịch đệm acid bù phần hao hụt sau microwave, để 30 phút ở nhiệt độ phòng.
9. Đặt phiến kính trong nước cất 3 phút
10. Đặt lần lượt trong các hộp ethanol theo nồng độ tăng dần:75% (x1); 96% (x2); 100% (x1) (2 phút/hộp)
11. Peroxidase activity blocking: 3% H2O2 Methanol, 30 phút (1ml/lam kính)
12. Ethanol 100%(x1); 96% (x2); 75% (x1) (2 phút/hộp)
13. Nước cất 3 phút
14. Rửa hai lần trong 1XPBS (5 phút/hộp; vẩy nhẹ)
15. Đặt lam kính trên các thanh đỡ đặt trên mặt hộp nhựa có chứa dung dịch đệm để làm ẩm (lưu ý không để mô gắn trên lam kính bị khô)
15. Blocking of non-specific binding of immunoglobulin with Normal Goat serum blocking solution **For 3 ml: Bovine albumin 7.5% (400μl)+Goat normal serum(30 μl)+ 1X
Phủ hoàn toàn bề mặt của mô (khoảng 500ul/lam kính). Ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
16. Rửa bằng 1X PBS và tiếp tục đặt trong 1X PBS 5 phút (2 lần); vẩy nhẹ
17. Phủ bằng primary antibody (1:800) (khoảng 200 μl/lam kính). Ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng.
(Lam kính đối chứng được phủ bằng 1X PBS)
18. Rửa bằng 1X PBS và chuyển vào hộp chứa 1X PBS (3 lần, 5 phút/hộp; vẩy nhẹ) (Chú ý: Đặt lam kính trên các thanh đỡ đặt trên hộp, phủ phía trên phiến kính kính bằng giấy tráng nhôm để tránh ánh sáng)
19. Phủ phần mô được gắn bằng secondary antibody; để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút(khoảng 200 μl/lam kính).
20. Rửa 1X PBS và đặt trong 1X PBS 5 phút/hộp (2 hộp), vẩy nhẹ)
21. Rửa trong DAB từ 10 đến 15 phút (200 μl /lam kính) đến khi phần mô được nhuộm chuyển sang màu nâu
22. Rửa bằng nước cất sau đó cho vào hộp nước cất trong 5 phút, vẩy nhẹ
23. "Nhúng" lam kính trong Haematoxylin khoảng 15 giây
24. Rửa bằng nước máy 3 phút sau đó đặt dưới vòi nước chảy 5-10 phút
25. Rửa trong hộp nước cất 5 phút.
26. Ethanol: 75% (x1); 96% (x2); 100% (x3) (3 phút/hộp)
27. Xylen (x3) (5 phút/hộp)
28. Gắn lamen; tiêu bản đã sẵn sàng để quan sát dưới kính hiển vi!!!!
