Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn

Từ Thư viện Khoa học VLOS
Bước tới: chuyển hướng, tìm kiếm
Chia sẻ lên facebook Chia sẻ lên twitter Chia sẻ lên google-plus In trang này

Trong những năm gần đây, kỹ thuật sản xuất protein tái tổ hợp trong các hệ thống sinh học ngày càng được ứng dụng rộng rãi và thường xuyên. Trong đó, các "nhà máy" vi khuẩn thường được lựa chọn do chi phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh. Hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử đều giữ ít nhất một chủng E. coli biểu hiện trong tủ lạnh sâu. Và không chỉ tất cả các nghiên cứu viên trong lab đều quen thuộc mà cả các sinh viên khi lên thực tập cũng được giới thiệu kỹ thuật này. Vì rằng mỗi thí nghiệm có một mục đích biểu hiện khác nhau nên thường không có quy trình chuẩn duy nhất. Và gần như đã thành thông lệ, những "nghệ sĩ" biểu hiện luôn phải đối mặt với những kết quả thất bại do chết tế bào, không mọc khuẩn lạc tái tổ hợp, protein ở thể không tan, protein bị bất hoạt, lượng protein tạo ra hoặc hoạt tính enzyme của protein thấp hoặc không có.

Vậy khi đó chúng ta phải làm gì và bắt đầu giải quyết từ đâu? Tất nhiên là sẽ có rất nhiều con đường cùng dẫn đến thành Roma nhưng đâu là con đường đơn giản và dễ dàng nhất vì chúng ta rất dễ đi nhầm vào một con đường vừa dài, chông gai và đôi khi hơi cay đắng nữa.

Xem lại trình tự protein quan tâm

Mã di truyền với 61 codon nhưng lượng tRNA của mỗi loại không giống nhau ở các loài sinh vật

Để tránh một con đường chông gai và cay đắng thì cách tốt nhất là hãy cùng kiểm tra lại trình tự protein quan tâm và sau đó thì lựa chọn hệ thống biểu hiện phù hợp cho nó. Rất nhiều protein từ sinh vật eukaryote chỉ có hoạt tính khi ở dạng đường hóa (glycosylated). Thông thường, các hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn không có khả năng đường hóa protein. Nếu protein mà bạn quan tâm đòi hỏi phải được chế biến sau dịch mã mới có hoạt tính thì chắc chắn hệ biểu hiện ở vi khuẩn không thể là giải pháp. Bạn hãy thử với những hệ thống biểu hiện ở nấm men, nấm sợi, tế bào côn trùng hoặc động vật.

Một vấn đề then chốt trong kỹ thuật biểu hiện chính là khả năng mã (codon usage). Trước khi bắt tay vào thí nghiệm, bạn nên so sánh khả năng mã của vật chủ với thành phần codon trong gene mã hóa protein quan tâm. Những codon hiếm như AGG, AGA, CUA, AUA, CCC và GGA sẽ là những trở ngại khi cố gắng biểu hiện trong tế bào E. coli. Mỗi amino acid có thể được mã hóa bởi nhiều hơn một codon và đối với mỗi loài sinh vật, hệ thống di truyền thường ưa thích một số codon này hơn những codon còn lại trong tất cả 61 codon có khả năng mã hóa. Trong từng tế bào, số lượng của mỗi thành phần RNA vận chuyển có liên quan chắt chẽ đến khả năng mã của mRNA có tính đặc trưng loài. Khi muốn sản xuất lượng lớn protein trong E. coli từ một mRNA khác biệt về khả năng mã của vật chủ, lượng sản phẩm protein tạo ra sẽ không thể nhiều bằng những protein khác được biểu hiện trong cùng hệ thống do tế bào không đủ một hoặc một số tRNA nhất định. Việc thiếu tRNA này có thể làm dừng quá trình dịch mã giữa chừng hoặc làm lệch khung đọc dẫn đến thay đổi trình tự amino acid trong sản phẩm protein. Quá trình tối ưu hóa khả năng mã hoặc hóa tổng hợp gene cấu trúc có thể khắc phục được sự khác biệt này. Việc tổng hợp hóa học một gene ngày nay đã khá thuận tiện và giá thành có thể xuống đến 1 dolla một cặp nucleotide. Trong ngành công nghệ dược phẩm, kỹ thuật này đã được sử dụng triệt để và dường như việc áp dụng kỹ thuật này rộng rãi trong các phòng nghiên cứu chỉ là vấn đề thời gian.

Nhà máy E. coli

Nhà máy E. coli.

E. coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram âm được ưa chuộng nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp. Một trong những lý do là vì những thao tác kỹ thuật với E. coli khá dễ dàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thí nghiệm. Thông thường, tất cả các chủng E. coli dùng trong biểu hiện đều xuất phát từ chủng E. coli K-12 hay B. Sự khác nhau giữa các chủng biểu hiện được phát triển và thương mại hiện nay là nhằm để giảm thiểu những vấn đề biểu hiện nhất định (xem chi tiết ở bảng phía dưới). Rất nhiều hệ thống promoter đã được thiết kế cho việc biểu hiện protein tuy nhiên chỉ có một số ít trở nên phổ biến và thương mại. Một promoter hữu ích phải có khả năng biểu hiện mạnh, có một mức độ biểu hiện nền thấp và dễ dàng chuyển nạp giữa các chủng E. coli khác nhau. Ngoài ra quá trình cảm ứng cũng cần đơn giản và rẻ tiền.

Một trong những bất lợi trong việc sản xuất protein ở E. coli nhằm mục đích liệu pháp y học là thường lẫn với lipopolysaccharide, một loại nội độc tố ở người. Vì lý do như vậy mà một số loài vật chủ vi khuẩn khác như Caulobacter, Staphylococcus và Streptomyces được lựa chọn để biểu hiện protein. Các chủng vi khuẩn Bacillus Gram dương cũng là vật chủ được ưa thích, trong đó phải kể đến B. megaterium, B. subtilisB. brevis. Những điểm nổi bật của các vật chủ này là: hoạt tính protease thấp, các plasmid tương đối bền về cả cấu trúc lẫn phân ly trong phân bào, khả năng sinh trưởng trên nhiều loại cơ chất khác nhau và hiệu suất biểu hiện cực cao. Trong đó, B. subtilis được nghiên cứu sâu và ứng dụng rộng rãi hơn 2 loài còn lại. Mức độ biểu hiện cao nhất là đạt được ở chủng đột biến sacUh. Chủng WB800 bị bất hoạt tất cả các protease ngoại bào và đã được tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và lên men quy mô lớn, tuy nhiên hiện giờ chưa được thương mại hóa. Các plasmid với promoter của operon xylose được sử dụng rộng rãi và cho mức độ biểu hiện gene cao nhất. Những gene này có thể được cảm ứng từ 130 đến 350 lần với 0.5% xylose.

Các sản phẩm protein được tạo ra thường hay kém tan hoặc nằm trong các thể không tan (inclusion bodies). Để khắc phục điều này, bạn có thể hạ thấp nhiệt độ nuôi cấy khi cảm ứng xuống tới 16°C, thay thế các amino acid, biểu hiện đồng thời với các chaperone, sử dụng đoạn amino acid kèm có tính ưa nước cao, bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy sorbitol, glycyl betain, sucrose, hoặc raffinose, thay đổi pH của môi trường nuôi cấy và sau cùng có thể đổi chủng vi khuẩn khác. Tuy nhiên, bạn có thể chọn cách khác là hòa tan trở lại và tái tạo cấu trúc của protein trong thể không tan để thu được protein có hoạt tính. Việc giảm nồng độ chất cảm ứng thi thoảng cũng có hiệu quả.

Để tăng cường khả năng biểu hiện các protein eukaryote hoặc protein có chứa codon hiếm ở E. coli, bạn có thể lựa chọn những chủng E. coli đã được cải biến di truyền phù hợp với mục đích này. Ngoài vấn đề vật chủ, promoter, thì số lượng bản sao plasmid cao, thấp hay trung bình cũng liên quan đến mức độ biểu hiện. Khi gắn protein tái tổ hợp với một đoạn cài (tag) lớn có thể làm tăng tính tan của tổng thể protein. Các đoạn cài liên kết maltose hoặc đoạn cài Sumo (Sumo-tags) có khả năng làm protein tan cực tốt, tuy nhiên lại kết vón sau khi loại bỏ đoạn cài khỏi protein tái tổ hợp. Protein với các cầu disulfide thường được tiết ra vùng ngoại vi bào chất (periplasm) thay vì trong tế bào chất (cytoplasm). Để định hướng tiết protein biểu hiện ra vùng ngoại vi bào chất, protein tái tổ hợp cần được gắn một đoạn peptide dẫn đường (leader peptide) ở phía đầu N. Thông thường các chủng E. coli K-12 hoặc B thường sử dụng cơ chế tiết protein kiểu I và kiểu II với các signal peptide sau: Lpp, LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, PelB, PhoA, PhoE, SpA và Tat.

Đọc đến đây có thể nhiều bạn muốn đặt câu hỏi: Vậy hệ thống biểu hiện nào tốt nhất?. Câu trả lời có lẽ làm bạn không hài lòng là Không có hệ thống nào là tốt nhất cho mọi trường hợp. Xin đừng thất vọng! Tuy nhiên, nếu không thì việc thiết kế biểu hiện protein sẽ trở nên một công việc tẻ nhạt chứ không nâng tầm thành một "nghệ thuật biểu hiện gene" như hiện nay. Vậy xin nhớ kỹ quy tắc ngón tay cái: kiểm tra trình tự protein trước tiên và sau đó lựa chọn một hệ biểu hiện phù hợp.

Các chủng E. coli biểu hiện thịnh hành

Một số chủng E. coli biểu hiện thịnh hành
 Chủng  Đặc điểm nổi bật
 AD494  đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất
 BL21  bất hoạt protease lonompT
 BL21 trxB  đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất
 bất hoạt protease lonompT
 BL21 CodonPlus-RIL  hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như AGG, AGA, AUA, CUA
 bất hoạt protease lonompT
 BL21 CodonPlus-RP  hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như AGG, AGA, CCC
 bất hoạt protease lonompT
 BLR  đột biến recA làm ổn định các vùng lặp
 bất hoạt protease lonompT
 C41/ C43  đột biến dành cho biểu hiện protein màng
 JM 83  tiết protein tái tổ hợp ra vùng ngoại vi tế bào chất
 Origami B  đột biến trxB/gor hỗ trợ cực tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide ở tế bào chất
 bất hoạt protease lonompT
 Rosetta-gami  hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC và GGA
 bất hoạt protease lonompT
 đột biến trxB/gor hỗ trợ cực tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide ở tế bào chất

Một số promoter biểu hiện trong E. coli

Một số promoter biểu hiện trong E. coli
 Hệ biểu hiện  Mức độ biểu hiện (chất cảm ứng)  Đặc điểm nổi bật
 lac promoter  từ thấp đến trung bình (IPTG)  biểu hiện yếu, có điều khiển; thường thích hợp để sản xuất những sản phẩm có nồng độ nội bào rất thấp
 chi phí cảm ứng khá cao
 T7 RNA polymerase  rất cao (IPTG)  sử dụng T7 RNA polymerase. Mức độ biểu hiện rất cao
 hệ thống T7lac có thể kiểm soát biểu hiện chặt chẽ trong trường hợp tạo chất có tính độc tế bào
 chi phí cảm ứng khá cao, độ biểu hiện nền thường phụ thuộc cả vào chủng vi khuẩn
 Phage promoter PL  tương đối cao (thay đổi nhiệt độ)  cần chủng vi khuẩn riêng nhạy nhiệt
 độ biểu hiện nền cao ở nhiệt độ dưới 30°C
 không cần chất cảm ứng
 tetA promoter  từ trung bình đến cao (an-hydrotetracyclin)  điều khiển chặt. Không phụ thuộc mức độ trao đổi chất và chủng E. coli.
 chi phí cảm ứng khá thấp. Độ biểu hiện nền thấp
 PRBAD promoter  từ thấp đến cao (L-arabinose)  có thể vi điều chỉnh mức độ biểu hiện.
 chi phí cảm ứng thấp. Độ biểu hiện nền thấp.
 rhaPBAD promoter  từ thấp đến cao (L-rhamnose)  điều khiển chặt. Độ biểu hiện nền thấp
 chi phí cảm ứng khá thấp

Liên kết tham khảo

Bài cùng thể loại

Liên kết đến đây

Chia sẻ lên facebook Chia sẻ lên twitter Chia sẻ lên google-plus In trang này