Quy trình phát hiện virus cúm gia cầm H5N1

Từ Thư viện Khoa học VLOS
Bước tới: chuyển hướng, tìm kiếm

Phần 1: Qui trình phát hiện virus cúm H5N1 bằng RT-PCR

Virus cúm H5N1 đã gây ra nhiều thiệt hại về tài sản và tính mạng cho nông dân cũng như cho người tiêu dùng. Vì vậy việc xây dựng quy trình phát hiện virus nhanh và chính xác là 1 trong những ưu tiên hàng đầu của tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO). Vừa qua, WHO đã ban hành quy trình phát hiện virus cúm H5N1 bằng RT-PCR vào tháng 08/2007

Vật liệu:

  1. QIAamp® Viral RNA Mini Kit(QIAGEN® Cat.No.51104)
  2. OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN®, Cat.No. 210212)
  3. RNase Inhibitor 20U/μl(Applied Biosystems Cat.No. N808-0119)
  4. RNase-free water
  5. Ethanol (96–100%)
  6. Máy ly tâm (Microcentrifuge)
  7. Pipettes
  8. Vortex
  9. Tube 0.2, 1.5ml
  10. Thermocycler
  11. Bộ Primers
  12. Chứng dương (positive control)
  13. Agarose
  14. Bộ nguồn điện di
  15. Máy chụp gel
  16. TAE buffer
  17. Ethidium bromide (10 mg/ml)
  18. Đệm load mẫu (Gel loading buffer 6X)
  19. Thang DNA (DNA ladder)

Primers:

Cặp primer phát hiện gene H5 thuộc Clade 1, 2, 3 (sản phẩm có kích thước mong muốn là 219 bp):

H5-1: GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC
H5-3: CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG

Cặp primer phát hiện Gene M thuộc Clade 1, 2, 3 (sản phẩm có kích thước mong muốn là 232 bp):

M30F: TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG
M264R2: ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG

Cặp primer phát hiện Gene N1 (sản phẩm có kích thước mong muốn là 616 bp):

N1-1: TTG CTT GGT CGG CAA GTG C
N1-2: CCA GTC CAC CCA TTT GGA TCC

Qui Trình:

1. Tách chiết RNA của virus từ mẫu bệnh lâm sàng bằng kit QIAamp® Viral RNA Mini Kit (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

2. Thực hiện RT-PCR 1 bước:

Đối với gene H5 hoặc N1:

Chuẩn bị master mix RT-PCR như sau:
5x QIAGEN® RT-PCR buffer 10 μl
dNTP mix 2 μl
5x Q-solution 10 μl
Forward primer (5 μM) 6 μl
Reverse primer (5 μM) 6 μl
Enzyme mix 2 μl
RNase inhibitor (20U/μl) 0.5 μl
Water (Molecular grade) 9 μl
RNA 5 μl
Tổng cộng 50 μl

Đối với gene M:

Chuẩn bị master mix RT-PCR như sau:
5x QIAGEN® RT-PCR buffer 10μl
dNTP mix 2 μl
Forward primer (5 μM) 6 μl
Reverse primer (5 μM) 6 μl
Enzyme mix 2 μl
RNase inhibitor (20U/μl) 0.5μl
Water (Molecular grade) 19μl
RNA 5 μl
Tổng cộng 50μl

3. Chu trình nhiệt:

Đối với gene H5, N1:

Bước 1: 50 °C/30 phút: 1 chu kỳ.
Bước 2: 95 °C/15 phút: 1 chu kỳ.
Bước 3: 40 chu kỳ
94 °C/30 giây.
55 °C/30 giây.
72 °C/30 giây.
Bước 4: 72 °C/2 phút: 1 chu kỳ.

Đối với gene M :

Bước 1: 50 °C/30 phút: 1 chu kỳ.
Bước 2: 95 °C/15 phút: 1 chu kỳ.
Bước 3: 40 chu kỳ
94 °C/30 giây.
50 °C/30 giây.
72 °C/30 giây.
Bước 4: 72 °C/2 phút: 1 chu kỳ.

4. Điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm RT-PCR. Chụp gel. Phân tích kết quả so sánh với chứng dương.

Nguồn

Liên kết đến đây