Thành viên:Cao Xuân Hiếu/Note: Tách BAC DNA từ GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit
Phương pháp tách DNA từ plasmid dựa trên nguyên tắc phá tế bào trong môi trường kiềm tính. Về nguyên tắc, DNA plasmid có kích thước nhỏ hơn so với DNA nhiễm sắc thể nên chúng dễ dàng tái bắt cặp khi dung dịch được trung hòa và giá trị pH hạ thấp. Lúc này DNA plasmid sau khi tái bắt cặp sẽ có tính tan tốt và đa phần nằm ở dịch nổi trong khi DNA nhiễm sắc thể vẫn không tan và bị lắng xuống cặn khi ly tâm.
Việc sử dụng các miniprep kit cho phép người dùng có được plasmid sạch hơn, không bị lẫn dung môi hữu cơ như trường hợp chiết qua Phenol/ P:C:I. Tuy nhiên, có những thách thức nhất định trong quy trình tương đối đơn giản này khi ta phải làm việc với 1) DNA plasmid kích thước lớn (dễ lẫn tạp với DNA nhiễm sắc thể) và 2) plasmid có số lượng phiên bản nội bào nhỏ (hàm lượng plasmid trên 1 đơn vị khối lượng tươi tế bào khá nhỏ; một số plasmid chỉ có từ 5 - 10 phiên bản trong 1 tế bào). Khi tách BAC DNA (Bacterial Artificial Chromosome) từ miniprep, ta phải đồng thời giải 2 bài toán này.
Bài toán:
- Dùng 4 BAC pool (10ul) chứa vài nghìn BAC khác nhau.
- Tách từ dịch nuôi qua đêm trong môi trường LB+FM
- Thu được đủ lượng mà duy trì tính đại diện các BAC
Thí nghiệm:
- Dùng 4mL/16mL dịch nuôi qua đêm, chia 2 ống để phá tế bào, rồi đưa chung vào 1 cột, làm theo protocol => thu được hiệu suất trên 1mL dịch nuôi như sau: 0.49 ± 0.02 / 0.43 ± 0.03 (μg DNA /mL dịch nuôi). Kiểm định t-test theo cặp cho thấy 2 nhóm khác nhau về mặt thống kê (P=0.003 2 phía), như vậy có sự khác nhau giữa việc 1) chia mẫu ra ống và gộp vào cột; 2) gộp tại ống phá tế bào trước khi gộp vào cột.
Kiểm định:
- PCR với cặp mồi đặc hiệu cho 3 BAC trong số vài nghìn BAC của mỗi pool. Kết quả tốt so sánh ngang với plasmid tách từ mediprep. Nhóm tách từ 4mL dịch nuôi cho lượng sản phẩm PCR cuối cùng ít hơn với nhóm tách từ 16mL (trong 2/4 trường hợp). Từ 4mL dịch nuôi, ta có thể nhận được DNA đủ dùng cho 250 phản ứng PCR.
Mẹo nhỏ
- Ủ EB (Elution Buffer) tại 65oC trước khi lên màng để thu DNA. Dùng 2 x 50 ul cho trường hợp 16mL
- Giữ 3 min ở bước S2 và 5 min ở bước S3
