Thành viên:Cao Xuân Hiếu/Note: Xác định băng protein biểu hiện bằng SDS PAGE

Từ VLOS
Bước tới: chuyển hướng, tìm kiếm

1. Nuôi vk qua đêm trong mt có kháng sinh thích hợp (V=5mL). Tốt nhất là bắt đầu từ 1 khuẩn lạc trên đĩa thạch. Dùng 2 culture là 1) sample = vk mang recombinant plasmid; 2) control = vk cùng dòng (genetic background) mang empty plasmid. Nếu ko có thì lấy vk cùng genetic background là OK.

2. Đo OD của 02 culture ovn. Bắt đầu 03 môi trường mới (V=5mL) có kháng sinh (2x sample + 01 control). Cho vào môi trường 1 thể tích nhất định của culture ovn sao cho nồng độ OD cuối là 0.05 OD unit/mL

3. Theo dõi OD660 cho đến khi OD đạt 0.4 thì bỏ IPTG vào 1 sample và 1 control.

4. Chờ 2 giờ sau thì do lại OD660 và thu 01mL của 03 culture: 1) sample + IPTG, 2) sample - IPTG, 3) control + IPTG

5. Ly tâm thu cặn tế bào 6000 rpm, 8 min. Cất vào -20oC cho qua đêm.

6. Hòa cặn tế bào trong dung dịch 2x SDS sample buffer với thể tích tương ứng sao cho nồng độ cuối là 0.01OD unit/ ul (microlitter). Dựa vào giá trị OD đo sau khi cảm ứng 2h.

7. Heat eppendorf ở 98oC trong 10min. Spin down.

8. Load lên gel 05 ul trong mỗi giếng theo thứ tự 1) Protein ladder (marker), 2) control + IPTG, 3) sample - IPTG, 4) sample + IPTG

9 Nhuộm coomassie blue rồi scan gửi lên đây. Cứ băng cục gạch nào ở lane số 4 mà ko có ở các lane khác là chính nó.

Good luck,

Lấy từ “https://tusach.thuvienkhoahoc.com/index.php?title=Thành_viên:Cao_Xuân_Hiếu/Note:_Xác_định_băng_protein_biểu_hiện_bằng_SDS_PAGE&oldid=62936”